用細胞刮刀實(shí)驗時(shí)

　　實(shí)驗步驟：無(wú)菌條件下取新生小牛大腦皮層灰質(zhì)部，4℃D-Hank′s液洗滌4次，至無(wú)血跡殘留。剪成1mm3左右的組織碎塊并置于玻璃勻漿器內，加入兩倍體積的MEM培養基，勻漿上下20次？勻漿液先用100目（直徑149μm）尼龍網(wǎng)布式漏斗抽濾，培養基洗滌4次，收集濾液。然后用200目（直徑74μm）尼龍網(wǎng)布式漏斗抽濾，MEM培養基洗滌4次。細胞刮刀收集200目尼龍網(wǎng)上的組織（即牛腦微血管），將其置于離心管中，1500r/min離心洗滌10min。離心洗滌的腦微血管懸浮于的0.1%膠原酶中，旋渦振蕩15sec以充分混勻，置于37℃恒溫振蕩水浴箱中振蕩消化50min？取出后旋渦振蕩15sec，1500r/min離心10min，棄上清，用20%BCS的培養基懸浮，接種于明膠鋪被的培養瓶中（培養瓶中加入1%明膠-D-Hank′s液洗滌3ml，37℃孵箱中放置24h，用前倒掉明膠溶液即得明膠覆蓋的培養瓶），置于細胞培養箱中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。靜置5～7天后，可見(jiàn)少量細胞生長(cháng)，20%BCS的MEM培養液換液，以后每2～3天換液一次，至細胞長(cháng)成致密單層后可傳代培養。

　　1、提前準備好Matrigel（BD 354277）包被過(guò)的六孔板，吸棄孔內包被液，加入2ml BeYaMATM 1*培養液。

　　2、吸棄待傳代hESCs/hiPSCs孔內的培養液，并用1ml無(wú)鈣鎂的PBS洗1遍。

　　3、加入0.5ml Accutase細胞分離液使之*覆蓋皿底。

　　4、室溫孵育5-8分鐘或37℃孵育3-5分鐘，顯微鏡下觀(guān)察到大部分克隆細胞間出現間隙，細胞表面發(fā)亮但尚未相互分離時(shí)，可吸去Accutase。

　　5、可將培養板放置37℃繼續孵育1min,或者直接加入適量新鮮BeYaMATM 1*培養液，輕輕搖晃，干細胞集落基本脫落。亦可用細胞刮刀將剩余克隆輕輕刮下，盡量避免用槍頭反復吹打細胞。

　　6、將制備好的細胞懸液按1：3-1：6的比例接種至準備好的培養板中，注意細胞過(guò)密則克隆邊界不圓滑，易分化，細胞過(guò)稀則克隆存活率降低。

　　7、輕輕搖晃培養板讓細胞均勻分散，置于37℃，5%CO2培養箱中培養8小時(shí)。

　　8、每天更換培養液，待細胞密度達到80%以上，或者克隆中央密度過(guò)大，影響細胞生長(cháng)時(shí)進(jìn)行傳代。