細胞培養的常見(jiàn)污染原因及其預防

　　如何保持無(wú)菌，是每個(gè)細胞培養實(shí)驗室一直面對的難題。污染幾率增加的主要原因包括：操作技術(shù)不嚴格，試劑質(zhì)量不達標，大氣中孢子計數增加，培養箱或操作臺使用和維護不當，污染了的冰箱和水浴鍋。因此，在細胞培養過(guò)程中，操作者不僅要嚴格遵守標準的操作程序，同時(shí)還要特別注意新產(chǎn)品、新品牌、以及設備的清潔維護。

　　細胞作為重要的實(shí)驗模型廣泛應用于各類(lèi)生物實(shí)驗,幾乎所有科研實(shí)驗室中都需進(jìn)行細胞培養。細胞培養過(guò)程中最大的威脅就是細胞污染,凡是混入細胞培養環(huán)境中,對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視為污染。細胞一旦遭到污染,所有的實(shí)驗結果都會(huì )變得毫無(wú)意義。因此,及時(shí)檢測并鑒定出所培養的細胞是否被污染至關(guān)重要。

　　污染來(lái)源

　　細胞培養實(shí)驗室要求保持無(wú)菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。細胞培養室要相對封閉，潔凈無(wú)塵，設有緩沖間。對實(shí)驗室進(jìn)行定期清掃、紫外消毒是避免細胞培養過(guò)程中由于實(shí)驗室環(huán)境引起細胞污染的主要措施，此外，實(shí)驗室內不要放太多雜物，保持實(shí)驗室干燥，有利于降低因實(shí)驗室條件引起的細胞污染率。

　　細胞培養過(guò)程中實(shí)驗人員是否操作規范，是否嚴格遵守無(wú)菌工作流程，是細胞污染的一個(gè)主要因素。操作人員進(jìn)培養室前，必須先洗手，在緩沖間換穿專(zhuān)用實(shí)驗服和拖鞋，嚴禁在實(shí)驗進(jìn)行時(shí)頻繁出入培養室。實(shí)驗后應將實(shí)驗產(chǎn)生的廢物和廢液及時(shí)清理出培養室，并清潔無(wú)菌工作臺。

　　常見(jiàn)污染原因

　　1、細菌、真菌污染

　　細菌和真菌污染很容易被檢測,因為受到細菌、真菌污染的細胞,培養過(guò)程中培養基會(huì )出現肉眼可見(jiàn)的明顯特征。細菌污染會(huì )導致培養基出現渾濁、顏色改變以及pH值急劇變化,受污染的貼壁細胞在幾天內會(huì )逐漸脫壁死亡。真菌污染后的細胞生長(cháng)速度變慢,培養基中會(huì )漂浮白色、淺黃色或黑色的小點(diǎn)。因此,通過(guò)觀(guān)察培養基的顏色、漂浮物、pH值或在顯微鏡下觀(guān)察細胞及其生長(cháng)狀態(tài),從而能初步判斷該細胞是否受細菌、真菌污染。也可以使用培養檢測法：將細胞培養物在各類(lèi)培養基中適溫培養若干天后,觀(guān)察是否有細菌或真菌生長(cháng)。

　　2、支原體污染

　　支原體污染會(huì )影響細胞的形態(tài)、功能、代謝、細胞膜、生長(cháng)速率、誘導染色體畸變、細胞內信號傳導等各種細胞特性。受支原體污染的細胞在培養時(shí)培養基的pH值不會(huì )發(fā)生改變,也不會(huì )渾濁,因此,很難直接觀(guān)察出細胞是否受到污染。

　　常用的支原體檢測DNA熒光染色法：使用熒光染料DAPI或Hoechst33258染色，熒光染料能選擇性的結合細胞和支原體DNA的小溝,因此,在準備過(guò)程中,任何存在的DNA均會(huì )被染色。被支原體污染的細胞經(jīng)染色后,細胞核外與細胞周?chē)煽吹皆S多大小均一的熒光點(diǎn)。

　　3、霉菌污染

　　霉菌污染早期，應用PBS多次沖洗細胞，盡量將孢子洗掉，然后用兩性霉素處理。兩性霉素對細胞生長(cháng)影響也很大，濃度過(guò)高可致細胞死亡，濃度過(guò)低時(shí)則不能抑制霉菌生長(cháng)。

　　4、病毒污染

　　有關(guān)病毒污染的資料不多，但一般認為病毒污染不影響細胞培養，通過(guò)PCR技術(shù)可以檢測。不過(guò)病毒污染對生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，至今，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作的難題。有研究顯示用伽馬射線(xiàn)可清除牛血清的大部分病毒，現如今值得期待的是下游工藝中除病毒過(guò)濾器的開(kāi)發(fā)。

　　結合文獻報道和本人的實(shí)際經(jīng)驗認為，在細胞培養過(guò)程中，潛在的污染途徑主要包括操作技術(shù)和環(huán)境，其中環(huán)境因素又包括了無(wú)菌試劑和材料、超凈工作臺、恒溫恒濕培養箱、水浴鍋和冰箱等。

　　一、操作技術(shù)

　　培養操作前——

　?、艂€(gè)人衛生：進(jìn)入細胞培養室時(shí)應更換實(shí)驗室專(zhuān)用鞋或者穿鞋套；穿戴實(shí)驗服、口罩和手套，用消毒酒精（75%濃度的乙醇）擦拭雙手；如果操作者是長(cháng)發(fā)，應扎于腦后。

　?、乒ぷ髋_準備：提前0.5~1h打開(kāi)超凈臺的紫外燈進(jìn)行消毒；用蘸有消毒酒精的紙巾擦拭超凈臺的臺面、擋板等。

　?、窃噭蕚洌簭睦洳厥一蚶鋬鍪胰〕鏊璧呐囵B基等試劑，于37℃水浴鍋中進(jìn)行加熱；加熱后用消毒酒精擦拭瓶身，并立馬放入超凈工作臺內。

　　須注意的事項有：外套、書(shū)包等物品，易附著(zhù)豐富的微生物，不應帶入細胞房。

　　培養操作中——

　?、排_面布置：按實(shí)驗需要和個(gè)人習慣，合理放置試劑、耗材、儀器等物品；點(diǎn)燃酒精燈后開(kāi)始實(shí)驗操作。

　?、撇僮鳎嚎拷鹧孢M(jìn)行實(shí)驗操作；試劑瓶經(jīng)火焰旋轉灼燒后打開(kāi)；挑選吸管，快速的縱向在火焰上來(lái)回移動(dòng)并做180°旋轉；將試劑瓶向吸管傾斜，吸出所需的液體量；灼燒瓶頸后，重新蓋上蓋子；等所有操作完畢后，擰緊瓶蓋。

　　須注意的事項有：操作要準確、敏捷、有序；吸取溶液時(shí)，應專(zhuān)管專(zhuān)用，避免交叉污染；吸管管口要向下傾斜，以防止液體倒流進(jìn)入移液器內發(fā)生污染；盡量減少細胞和培養基的敞口時(shí)間；已開(kāi)口的試劑瓶盡可能的傾斜放置，防止下落微生物的污染；避免在敞口的細胞培養皿及培養皿蓋上方操作；不要面對工作臺或細胞培養箱講話(huà)或咳嗽，防止口腔微生物隨唾沫飛入而發(fā)生污染；若發(fā)生外溢，用蘸有消毒酒精的棉球及時(shí)擦去。

　　培養操作后

　?、耪恚簩⒃噭┓呕卦瓉?lái)的存儲位置；整理工作臺面，物歸原位，合理丟棄廢液和廢物。

　?、葡荆河孟揪凭潦门_面；打開(kāi)超凈工作臺和細胞房的紫外燈，照射至少15min。

　　須注意的事項有：紫外燈開(kāi)啟后，人不能進(jìn)入，紫外線(xiàn)對眼睛和裸露的皮膚均有危害，若要進(jìn)入，一定要先關(guān)閉紫外燈，待人離開(kāi)后打開(kāi)。

　　二、環(huán)境

　　如果操作者技術(shù)規范且操作嚴謹，那么當環(huán)境惡化時(shí)，也會(huì )導致污染風(fēng)險的增加。進(jìn)行細胞培養時(shí)，環(huán)境必須潔凈。

　　恒溫恒濕培養箱——細胞污染一個(gè)主要的途徑就是恒溫恒濕培養箱。恒溫恒濕培養箱，在培養細胞取出和放入的過(guò)程中，直接與空氣接觸，微生物會(huì )被夾帶進(jìn)入；加之其內部濕度高、溫度適宜，特別有利于真菌繁殖。細胞培養瓶或培養皿，如果接觸了操作臺以外的地方，在放入培養箱前須經(jīng)消毒酒精擦拭。但須注意的是，消毒酒精要經(jīng)操作臺吹干，否則會(huì )導致培養箱內乙醇濃度升高，酒精會(huì )影響細胞的正常功能。

　　在很多情況下，細胞培養必須使用恒溫恒濕培養箱。為了有效的控制該污染途徑，可采取的措施有：①在加濕托盤(pán)內添加真菌抑制劑，如硫酸銅、十二烷基磺酸鈉，可抑制托盤(pán)內真菌的生長(cháng)；亦或盛裝無(wú)菌的去離子水，并每周進(jìn)行更換，托盤(pán)用消毒酒精或高溫滅菌的方法進(jìn)行嚴格的清潔；②使用無(wú)毒抗真菌清潔劑對培養箱內外進(jìn)行定期清潔，先用清潔劑、再用消毒酒精進(jìn)行擦拭；為不留死角，清潔前應將培養箱內部能拆卸的部件都拆卸下來(lái)，清潔時(shí)也特別要注意不能拆卸的犄角旮旯處；③不正確的使用空氣過(guò)濾器，那將變?yōu)榕囵B箱一個(gè)可怕的污染途徑，故須按使用說(shuō)明定期更換空氣過(guò)濾器；④在使用過(guò)程中，任何溢出液必須立刻用消毒酒精清除干凈；⑤一旦發(fā)現培養物被污染，立馬清走。