細胞培養離開(kāi)這幾個(gè)條件，成功率極低

　　細胞培養的條件一般離不開(kāi)這5個(gè)：合適的細胞培養基、優(yōu)質(zhì)血清、無(wú)菌無(wú)毒細胞培養環(huán)境、恒定的細胞生長(cháng)溫度、合適的氣體環(huán)境

　　絕大部分細胞消化的時(shí)候是只要用胰酶潤洗一遍即可。吸去胰酶后，殘留的那些無(wú)法計算體積的附著(zhù)在細胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細胞（絕大部分1min不到）。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞，連續這樣傳代，對細胞傷害很大。

　　不是細胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了，一般你肉眼觀(guān)察貼壁細胞層，只要能移動(dòng)了，多半呈沙壯移動(dòng)，其實(shí)已經(jīng)可以了，很多人喜歡把細胞消化或者吹打成*分離細胞，這是沒(méi)有必要的。一般能移動(dòng)了，說(shuō)明細胞與培養基質(zhì)材料的附著(zhù)已經(jīng)消失了，細胞之間的附著(zhù)也已經(jīng)消失了，細胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒(méi)有呈現很廣的離散分布）。這個(gè)時(shí)候應該停止消化，不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。

　　細胞就是*成單個(gè)細胞懸液，之后在貼壁的過(guò)程中仍然會(huì )聚集，這個(gè)是貼壁培養的細胞，尤其是腫瘤細胞的一個(gè)特性，無(wú)論死活的細胞都是如此，你可以嘗試，準備100%的單個(gè)細胞懸液，貼壁后觀(guān)察細胞，仍然是幾個(gè)幾個(gè)細胞聚集在一起。一些懸浮培養細胞也是如此，容易聚集，不要去嘗試過(guò)幾個(gè)小時(shí)就拿出來(lái)吹打成單細胞懸液（不要笑，這個(gè)是初養懸浮細胞的人常犯的錯誤，以為懸浮培養就是一個(gè)一個(gè)分開(kāi)）。細胞只要能從基質(zhì)上脫離下來(lái)，這個(gè)時(shí)候即使是成片的（比如Calu-3細胞），吹打不超過(guò)20次后（一般10次即可），成小規模聚集（10個(gè)細胞左右），是正常的，不要試圖再去延長(cháng)消化時(shí)間，或者象有的同學(xué)那樣吹打1h，等待單細胞懸液出現。

　　比較難消化的細胞（潤洗方法5min還不能消化），就以coloncancer為例，比如HCT15,LS411和KM12，這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100mmdish，一次多加入500ul，就足夠了，一般我加300ul。即使這樣難消化的細胞，一般不超過(guò)5min，即可見(jiàn)細胞成片移動(dòng)，就應該停止消化。一些正常細胞也會(huì )有難消化的時(shí)候，比如tsDC細胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動(dòng)。