細胞培養知識（四）

1.如何選用培養基？
   培養某一類(lèi)型細胞沒(méi)有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(cháng)?？傊?，MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養，各種目的無(wú)血清培養的是AIM V培養基（SFM）。
 
2.為什么要熱滅活血清？
   加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養ES細胞、昆蟲(chóng)細胞和平滑肌細胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。

3.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？
   它在溶液中不穩定嗎？ L-谷氨酰胺在細胞培養時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì )降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有zui終確定。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？
   培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩定？ GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，將其不穩定的α-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

5.為什么培養基中可以省去加酚紅？
   酚紅在培養基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應，培養細胞，尤其是哺乳類(lèi)細胞時(shí)，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養基。

6.如何用臺盼蘭計數活細胞？
   用無(wú)血清培養基把細胞懸液稀釋到200-2000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。

7.如何消除組織培養的污染？
   當重要的培養污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過(guò)濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實(shí)驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè )菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實(shí)驗步驟。
  1）在無(wú)抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。
  2）分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個(gè)小培養瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
  3）每天觀(guān)測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。
  4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2-3代。
  5）在無(wú)抗生素的培養基中培養細胞一代。
  6）重復步驟4。
  7）在無(wú)抗生素的培養基中培養4-6代，確定污染是否以已被消除。

8.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？
   丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話(huà)，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？
   Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？ HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L） 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì )變堿，Hanks液在CO2培養箱中會(huì )變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
   Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序，而且除了這些標準檢測，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌體檢驗生物化學(xué)檢測 激素的檢測血紅蛋白檢測Sf9 細胞生長(cháng)促進(jìn)及方法學(xué)檢測

11.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？
   二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來(lái)自培養基中所有的二價(jià)離子。

12.制備 lipid-DNA的方法會(huì )影響轉染效率嗎？
   是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中?；旌蟽煞N溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復合物在沒(méi)有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復合物中加入含有血清的培養基（800μl）。（注意以上是35mm培養皿使用體積）。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個(gè)很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體，接下來(lái)可以不需要換培養基的情況下直接加入。

13.我使用SF900 Ⅱ時(shí)，細胞生長(cháng)良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效果好？
   如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會(huì )作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無(wú)血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。為了避免這一問(wèn)題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

14.如何檢測內毒素（熱源）水平？
   LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的zui敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現細菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內的凝集作用。內毒素啟動(dòng)一個(gè)細胞內酶原系統（絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應系統），通過(guò)修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟（血細胞）裂解物。胎牛血清的內毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對血清產(chǎn)品進(jìn)行內毒素檢測前，用無(wú)熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內毒素結合成份的出現會(huì )抑制凝膠過(guò)程，使內毒素不能與LAL反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。）

 15.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養基嗎？
   如果使用固體形式的培養基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免MS培養基的直接滅菌，應該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養基中。

16. 20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會(huì )改變嗎？
   對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變10℃時(shí)，PH值的變化情況例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時(shí)PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.7817. 室溫下（25℃）配制的

17.Tris-HCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少？
   緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同的PH值。

18. 昆蟲(chóng)細胞培養的zui適PH值和滲透壓是多少？
   生長(cháng)培養基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì )產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細胞系，在PH值 6.0-6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細胞系時(shí)，培養基的zui適滲透壓是 345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式，減少技術(shù)問(wèn)題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。

19. High Five細胞有任何其它名稱(chēng)嗎？
   High Five細胞也被稱(chēng)為T(mén)richoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

20.在High Five無(wú)血清培養基中去污劑的濃度是多少？
   High Five無(wú)血清培養基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

21.High Five細胞用多大的密度凍存？
   3.0x10E6 cells/ml

22.在我的果蠅培養基中發(fā)現形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細胞有害嗎？
   可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解，對實(shí)驗不會(huì )有不利的影響。

23.如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？
   我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術(shù)破壞性zui小，生活力zui高。通過(guò)使用巴氏德吸液管，讓細胞上培養基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細胞：1）去除培養基。2） 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS.3） 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。4） 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。5） 向細胞中加入2ml 細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養基中的FBS終止了胰酶的活性。）6） 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養基。7） 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。 24.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時(shí)，肝素的使用量是多少？ 為了防止懸浮培養細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。 25.如何評估ES細胞合格的胎牛血清？ 使用D3 ES細胞。這是一個(gè)對于胎牛血清中生長(cháng)促進(jìn)、生長(cháng)抑制和分化因子非常敏感的細胞系。相關(guān)生長(cháng)效率分析：當ES細胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長(cháng)培養基中，檢測開(kāi)始和支持ES細胞克隆的能力。細胞毒分析：當以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長(cháng)培養基中，檢測ES細胞和feeder細胞的生長(cháng)能力。相關(guān)形態(tài)學(xué)和分化分析：檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力。通過(guò)堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅，分化的細胞較大，豐滿(mǎn)，顏色較淺。所有的分析在沒(méi)有ESGRO的情況下進(jìn)行的，培養基中出現ESGRO會(huì )掩蓋由胎牛血清所導致的問(wèn)題。（ESGRO或LIF經(jīng)常用來(lái)保持ES細胞處于未分化狀態(tài)。）經(jīng)過(guò)培養發(fā)現，大約8批中有1批可以用來(lái)培養ES細胞。

26.在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著(zhù)傳代的次數的增加，它的感染能力會(huì )降低嗎？
   通常情況當細胞經(jīng)過(guò)30次傳代后，應該返回凍存。無(wú)論什么時(shí)候記數時(shí)，都應該檢查細胞活力。如果超過(guò)95％的細胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。